小可憐蟲不搞那些了，搞點(diǎn)高大尚的

螞蟻崽崽不就是一個(gè)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)嗎，就聽著怪牛的，切～

龜哥WB，蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)又稱免疫印跡(immunoblotting)，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫生化技術(shù)，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。

小可憐蟲呦呦呦，這不是龜哥嗎，挺懂啊你

龜哥你以為

小可憐蟲WB實(shí)驗(yàn)步驟 1、收集蛋白樣品 蛋白提取的質(zhì)量直接決定著 WB 結(jié)果的好壞，因此，根據(jù)標(biāo)本類型和檢測(cè)類型選擇合適的蛋白制備方法是至關(guān)重要的。 使用Western及IP細(xì)胞裂解液裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品，為了防止蛋白的降解，或保證磷酸化或乙?；鞍椎姆€(wěn)定，需要額外添加蛋白酶抑制劑 / 蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑等蛋白抑制劑、或者乙?；敢种苿┗旌衔铩? 對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白的細(xì)胞核蛋白提取試劑盒 、細(xì)胞漿蛋白細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組分蛋白，也可使用商業(yè)化的試劑盒進(jìn)行提取。 收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。目前常用BAC試劑盒測(cè)定樣品蛋白的含量。

螞蟻崽崽我不太懂交給你們了

龜哥小菜似的

龜哥2、電泳 （1）蛋白樣品的變性 取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液（體積×蛋白質(zhì)濃度），并加等體積的sds-page蛋白上樣緩沖液，若樣品是非變性的，可加入非變性的上樣緩沖液。電泳樣品加入樣品處理液后，要經(jīng)過(guò)高溫處理，其目的是將SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)*變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)。樣品處理液中通常還加入溴酚藍(lán)染料，溴酚藍(lán)指示劑是一個(gè)較小的分子，可以自由通過(guò)凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的前沿位置，當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí)，即可停止電泳。另外樣品處理液中也可加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時(shí)樣品溶液可以沉入樣品凹槽底部。至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒，可立即使用也可以分裝凍存，-20℃存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月。

小可憐蟲（2）電泳凝膠制備 電泳凝膠的制備可以直接使用sds-page試劑盒進(jìn)行操作。

龜哥（3）上樣和電泳 冰上冷卻后，把將處理好的蛋白樣品按照預(yù)定的順序上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)中。注意的是加樣孔有多時(shí)，可加入等體積的上樣緩沖液，最后記得點(diǎn)上預(yù)染蛋白質(zhì)分子量Marker。預(yù)染Marker便于在電泳過(guò)程中監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)分離，也可以在隨后的轉(zhuǎn)膜步驟中指示轉(zhuǎn)移效率。Marker也用樣品緩沖液調(diào)整至與樣品等體積。 加足夠的電泳緩沖液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。