二、微生物培養(yǎng)與無菌技術(shù)核心知識(shí)梳理

一、無菌技術(shù)：防止雜菌污染的關(guān)鍵

核心目標(biāo)：獲得純凈微生物培養(yǎng)物，分為消毒和滅菌。

1. 消毒（溫和處理，部分殺菌）

- 定義：用物理、化學(xué)或生物方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。

- 常用方法及應(yīng)用：

方法 原理/特點(diǎn) 應(yīng)用場景

煮沸消毒法 100℃煮沸10-30分鐘 玻璃器皿、餐具

巴氏消毒法 62-65℃加熱30分鐘或70-75℃加熱15秒 牛奶、酒類（保留營養(yǎng)成分）

紫外線消毒 紫外線破壞DNA結(jié)構(gòu) 實(shí)驗(yàn)室空氣、操作臺(tái)、衣物

化學(xué)消毒 75%酒精（擦拭雙手）、氯氣（消毒水源） 皮膚、水源、實(shí)驗(yàn)設(shè)備

生物消毒 噬菌體裂解細(xì)菌 凈化污水

2. 滅菌（強(qiáng)烈處理，徹底殺菌）

- 定義：用理化方法殺死物體內(nèi)外所有微生物（包括芽孢和孢子）。

- 常用方法及應(yīng)用：

方法 條件 應(yīng)用場景

高壓蒸汽滅菌 121℃、100kPa、15-30分鐘 培養(yǎng)基、玻璃器皿、棉塞

灼燒滅菌 酒精燈火焰直接灼燒 接種環(huán)、涂布器、試管口

干熱滅菌 160-170℃、2小時(shí) 耐高溫干燥的玻璃/金屬器具

3. 操作原則

- 環(huán)境與人員：實(shí)驗(yàn)空間清潔，操作者手和衣物消毒（如酒精擦拭）。

- 器具與培養(yǎng)基：所有接觸培養(yǎng)物的器皿（培養(yǎng)皿、試管）和培養(yǎng)基必須滅菌。

- 無菌操作：在超凈工作臺(tái)或酒精燈火焰旁操作（火焰周圍形成無菌區(qū)域），避免滅菌后的器具接觸周圍物品。

難點(diǎn)解釋：

- 消毒 vs 滅菌：消毒不徹底（保留芽孢），滅菌徹底；例如，培養(yǎng)基必須滅菌（含芽孢會(huì)導(dǎo)致污染），而皮膚只需消毒（避免強(qiáng)刺激）。

- 為什么選擇巴氏消毒法？ 因高溫會(huì)破壞牛奶中的營養(yǎng)成分和口感，巴氏消毒在殺菌的同時(shí)最大限度保留營養(yǎng)（如維生素）。

二、微生物的純培養(yǎng)

核心概念：從單一微生物繁殖獲得純培養(yǎng)物，是微生物研究的基礎(chǔ)。

1. 純培養(yǎng)步驟

1.?配制培養(yǎng)基：

- 成分：碳源、氮源、水、無機(jī)鹽，按需添加特殊成分（如凝固劑瓊脂）。

- 流程：計(jì)算→稱量→溶解→定容→調(diào)pH→滅菌→倒平板。

- 關(guān)鍵細(xì)節(jié)：

- 斜面培養(yǎng)基需先分裝再滅菌，避免滅菌后分裝導(dǎo)致污染。

- 倒平板時(shí)，培養(yǎng)基冷卻至50℃左右（手背觸碰錐形瓶不燙手），避免高溫破壞皿蓋冷凝水。

2.?倒平板操作：

- 步驟：灼燒瓶口→打開培養(yǎng)皿縫隙→倒入培養(yǎng)基→倒置冷卻。

- 為什么倒置平板？ 防止皿蓋冷凝水倒流污染培養(yǎng)基，同時(shí)避免培養(yǎng)基水分過快蒸發(fā)。

- 污染判斷：若培養(yǎng)基濺到皿蓋與皿底之間，該平板不可用（空氣中微生物易在縫隙滋生）。

3.?接種與分離方法：

方法 原理 用途 關(guān)鍵區(qū)別

平板劃線法 通過連續(xù)劃線稀釋菌液，獲得單菌落 分離純菌種 無法計(jì)數(shù)，需多次劃線

稀釋涂布平板法 將菌液梯度稀釋后涂布，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù) 分離菌種并計(jì)數(shù) 需選擇30-300菌落的平板

操作要點(diǎn)：

- 劃線時(shí)每次灼燒接種環(huán)并冷卻，避免高溫殺死菌種；從上次劃線末端開始，逐步稀釋菌液。

- 涂布時(shí)菌液需完全吸收，避免菌落重疊影響計(jì)數(shù)。

4.?培養(yǎng)與觀察：

- 接種后平板倒置，放入恒溫箱（如酵母菌28℃培養(yǎng)24-48小時(shí)）。

- 設(shè)置未接種平板的意義：作為對照，若對照平板出現(xiàn)菌落，說明培養(yǎng)基或操作過程污染，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效。

難點(diǎn)解釋：

- 單菌落的意義：一個(gè)單菌落通常由單個(gè)微生物繁殖形成，是純培養(yǎng)物的標(biāo)志。

- 為什么菌落數(shù)比活菌數(shù)少？ 當(dāng)多個(gè)活菌連在一起時(shí)，平板上僅形成一個(gè)菌落（稀釋涂布平板法的計(jì)數(shù)誤差）。

三、菌種保存方法

方法 條件 適用范圍 操作要點(diǎn)

臨時(shí)保存 固體斜面培養(yǎng)基，4℃冰箱 短期使用（3-6個(gè)月） 定期轉(zhuǎn)接，避免菌種退化

甘油管藏（長期） 菌液與甘油混合，-20℃冷凍 長期保存（數(shù)年） 滅菌甘油需與菌液等體積混合

難點(diǎn)解釋：

- 臨時(shí)保存需定期轉(zhuǎn)接的原因：斜面培養(yǎng)基營養(yǎng)有限，長期保存會(huì)導(dǎo)致菌種衰老或死亡。

- 甘油管藏的原理：甘油作為保護(hù)劑，降低細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)晶對菌體的損傷，適合長期冷凍。

四、微生物的選擇培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

1. 選擇培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)原理

通過特定成分限制非目標(biāo)微生物生長，富集目標(biāo)菌種：

- 例子1：分離尿素分解菌

- 培養(yǎng)基：以尿素為唯一氮源，只有能分泌脲酶的細(xì)菌（如大腸桿菌）可生長。

- 鑒別：加入酚紅指示劑，分解尿素產(chǎn)生NH?使培養(yǎng)基pH升高，指示劑變紅。

- 例子2：分離纖維素分解菌

- 培養(yǎng)基：以纖維素為唯一碳源，僅能產(chǎn)生纖維素酶的細(xì)菌（如木霉）可利用。

- 鑒別：加入剛果紅，與纖維素形成紅色復(fù)合物；纖維素被分解后，菌落周圍出現(xiàn)透明圈（透明圈直徑/菌落直徑越大，分解能力越強(qiáng)）。

2. 計(jì)數(shù)方法對比

方法 原理 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)

稀釋涂布平板法 活菌形成單菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)推算活菌數(shù) 可區(qū)分活菌，誤差較小 操作繁瑣，不適用于運(yùn)動(dòng)細(xì)菌

顯微鏡直接計(jì)數(shù)法 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)（死菌活菌均算） 快速簡便 無法區(qū)分死活，小細(xì)菌難觀察

難點(diǎn)解釋：

- 選擇培養(yǎng)基的“唯一”原則：如“無氮培養(yǎng)基”僅固氮菌可生長，“無碳培養(yǎng)基”僅自養(yǎng)菌（如藍(lán)細(xì)菌）可利用CO?作為碳源。

- 剛果紅染色法的兩種操作：先培養(yǎng)后染色（避免剛果紅抑制微生物）或在培養(yǎng)基中直接加入剛果紅，均需形成透明圈判斷分解能力。

五、核心操作流程圖解

無菌技術(shù)流程：

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（清潔環(huán)境→消毒雙手）→器具滅菌（培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿高壓蒸汽滅菌）→

倒平板（冷卻至50℃→無菌操作倒平板→倒置凝固）→

接種（平板劃線法/稀釋涂布平板法，酒精燈旁操作）→

培養(yǎng)（倒置恒溫箱，設(shè)未接種對照）→

結(jié)果分析（對照無污染→單菌落分離成功）

總結(jié)與難點(diǎn)強(qiáng)化

1.?核心邏輯：無菌技術(shù)是基礎(chǔ)，純培養(yǎng)是目標(biāo)，選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)是應(yīng)用。

2.?易錯(cuò)點(diǎn)突破：

- 混淆消毒與滅菌的對象（芽孢是否被殺滅）；

- 忽略倒平板倒置的雙重作用（防污染+保水分）；

- 稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)時(shí)忘記“菌落可能由多個(gè)活菌形成”導(dǎo)致低估。

3.?學(xué)科思想：

- 選擇性原理：通過培養(yǎng)基成分設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)微生物的“優(yōu)汰劣勝”（如青霉素抑制細(xì)菌，分離真菌）；

- 量化思維：稀釋涂布平板法的數(shù)學(xué)邏輯（菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)÷涂布體積=活菌濃度）。

通過明確操作目的（如滅菌為何需高溫）、理解原理（如選擇培養(yǎng)基的篩選機(jī)制）、牢記特例（如巴氏消毒的低溫原因），可高效掌握微生物培養(yǎng)的核心考點(diǎn)。